結合物即酶標記的抗體（或抗原），是ELISA中至關重要的關鍵的試劑。良好的結合物應該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當的分子比例，在結合試劑中應盡量不含有或少含有游離的（未結合的）酶或游離的抗體（或抗原），此外，結合物尚要有良好的穩定性。
用于ELISA的酶應符合以下要求：
①純度高
②催化反應的轉化率高
③一性強
④性質穩定
⑤來源豐富
⑥價格不貴
⑦制備成酶結合物后仍繼續保存它的活性部分和催化能力
⑧在受檢標本中不存在相同的酶
⑨相應底物易于制備和保存，價格低廉，有色產物易于測定等
在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。在少數商品ELISA試劑中，應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。國產ELISA試劑一般都用HRP制備結合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一種卟啉蛋白質。主酶無色糖蛋白在275nm波優點有高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環，在403nm波優點有高吸收峰。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度數）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥7.0。
HRP除符合上述的ELISA中標記酶的要求外，更有價格低廉和性質較穩定的特點。值得留意的是，在選用酶制劑時，除其純度RZ外，更應留意酶的活力。高純度的酶如保存不當，活力也會降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對底物作用后天生產物量的測定進行試驗。
國外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標記酶。常用的AP有兩個來源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取的AP分子量為80000，酶作用的適合pH為8.0；用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000，適宜pH為9.6。在ELISA中，AP系統的敏感度一般高于HRP系統，空缺值也較低，但AP價格昂貴，制備結合物所得率也較HRP低。
制備結合物時所用抗體一般 均為純度較高的IgG，以免在與酶聯結時其他雜蛋白的干擾。用親和層析純的抗體，這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結果本底淺淡。如用F(ab)2進行標記，則更可避免標本中RF的干擾。在ELISA中用酶標抗原的模式未幾，總的要求是抗原必須是高純度的。
用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加進高濃度的無關蛋白質（例如1%牛血清白蛋白），通過競爭以抑制結合物的吸附。一般還加進具有抑制蛋白質吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時，血清標本需稀釋后進行測定，也可應用這種稀釋液。
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