小動物學習記憶行為檢測技術

               －－－－避暗法                          

一、實驗目的

1、學習小白鼠學習記憶行為檢測方法

   2、學習小鼠避暗自動測試儀的使用方法。

   3. 了解影響學習記憶功能的一些因素。

二、實驗原理

    嚙齒類動物系夜行性動物，喜歡黑暗的地方，而回避光亮之地。它將設法逃向暗處，此時在暗處給予其電刺激，小鼠會被迫逃回明亮處，并獲得記憶。根據此原理設計的實驗為一次性被動回避反應實驗。

被動回避反應（Passive Avoidance Response）為二十世紀60年代后期發展起來的、普遍用于檢測小動物學習記憶能力的一種動物模型。反應特征：動物必須學會躲避可怕的事件，而抑制其天然本性。被動回避反應有：避暗法（又稱步入法step-through test）、跳臺法（又稱步下法step-down test）等。

三、實驗器材

小白鼠 常用手術器械、亞**鈉、東莨菪堿（scopolamine，Scop.）、生理鹽水、35 %酒精。

四、實驗步驟 

1. 實驗儀器

小鼠避暗自動測試儀由控制器和活動箱兩部分組成，可同時對6只小鼠進行實驗。明暗實驗箱之間有一小門供動物進出，當動物進入暗室被電擊時，它可自動記錄小鼠次從明室進入暗室的潛伏期和受到電擊的次數，還可通過按鍵靈活地選擇刺激電壓和設置實驗時間。

2. 實驗程序：

2.1適應：將動物頭朝室壁放入明室，兩室之間的門洞敞開，讓動物在兩室內自由活動2-3分鐘，取出后放回飼養籠。

2.2訓練：第二天, 將動物放入明室, 它很快鉆入暗室, 連接兩室的門洞關閉，同時啟動電刺激器, 動物足部受電擊。如果動物在次訓練時超過100秒不進暗室, 淘汰之或用手把它輕輕趕進暗室。

記錄指標：

（1）記錄動物自明室進入暗室的潛伏期，可作為判斷給藥后動物行為是否有變的一個指標。若藥物致使動物鎮靜，則潛伏期顯著長于對照組。

（2）記錄動物受到電擊后的反應，如劇烈嘶叫并跳躍，評為A級反應；微弱尖叫，評為B級反應；不叫，評為C級反應。受到電擊后動物一般均跳躍。C級反應常伴動物跳躍，動物雖不尖叫，但正常動物均能感受電擊疼痛，顯示好的記憶成績。C級反應多見于雄性動物。A級反應多見于雌性動物。該記錄可作為動物痛域是否變化的一個輔助觀察指標。

2.3重測試：訓練后24小時（第三天），再次將動物放入明室，進行重測試。

記錄指標：

（1）記錄動物進入暗室的潛伏期，為步入潛伏期（step through latency, STL）。潛伏期設為300秒。

（2）記錄動物300秒內進入暗室的錯誤次數，包括次錯誤進入暗室的次數。

實驗設計舉例

按照信息論將記憶簡單劃分為：記憶的獲得（也即學習過程、信息的獲得過程）、記憶的鞏固（信息的保持過程）、記憶的再現（信息的提取過程）時，我們可依此來篩選作用于記憶不同階段的認知藥物。

在訓練前、后或重測前給損傷動物記憶的藥物，可分別觀察該藥物對記憶不同階段的影響，在此之前給動物待檢測認知藥物，即可依據實驗結果判斷該認知藥物對抗損傷藥物的效果。為簡化篩選工作，常選用實驗步驟較少的小動物學習記憶測試方法，現以步入法為例說明如下。原理如圖示。

適應 ———— 訓練（電擊）——— （24小時后）——— 重測（不電擊）

       影響           影響                    影響

        記憶獲得       記憶鞏固                記憶再現

一、記憶獲得過程

1. 建立記憶獲得障礙模型：

在動物進行電擊訓練之前15-20分鐘，給動物腹腔注射氫溴酸東莨菪堿（膽堿能M受體拮抗劑，HBr-Scopalamine），小鼠：3mg/kg，可見給藥組動物出現探究行為，訓練時在明室內駐留時間略長于對照組，進入暗室后受到電刺激時的反應與對照組相似：嘶叫或跳躍。24小時后當再次將動物放入明室時，動物進入暗室的潛伏期顯著低于對照組，即制備成功記憶障礙模型。

2. 待測藥物的服用：

根據待檢測藥物在動物體內的作用高峰時間，于相應時間給動物服藥，如口服藥物，可于訓練前1小時給動物灌服待檢測藥物，然后再于訓練前15-20分鐘給動物損傷記憶獲得的藥物，如氫溴酸東莨菪堿等。

二、記憶鞏固過程

1. 建立記憶鞏固障礙模型：

動物電擊訓練結束后立即給動物腹腔注射蛋白質合成抑制劑環己酰亞胺（Cycloheximide，小鼠：90-100mg/kg）抑制蛋白質合成，或皮下注射NaNO2（小鼠：120mg/kg）導致動物短暫性缺氧，或給動物施行頭部瞬間電休克。然后放回飼養盒內，24小時后重測試。

2. 待測藥物的服用：

若是口服藥物，于電擊訓練前藥物作用高峰期（一般選1小時前）給動物灌服藥物。若是腹腔注射藥物，一般于訓練前半小時注射。然后給動物電擊訓練，訓練后立即給損傷記憶鞏固藥物或其它實驗因素，24小時后重測試，可檢測認知藥物對記憶鞏固障礙的對抗作用。

三、記憶再現過程

1. 建立記憶再現障礙模型

于動物重測試之前15分鐘給小鼠灌服酒精（35%，0.1ml/10g鼠重），15分鐘后進行重測試。可見小鼠記憶提取過程受到損傷。

2. 待測藥物的服用：于動物重測試之前1小時給動物口服待檢藥物。

注意：

該損傷只有在重測前10-30分鐘灌胃酒精才起作用, 時間長于30分鐘則無效。

該劑量酒精只對較不鞏固、一次性記憶有損傷作用，而對小鼠需經多次訓練而獲得的較鞏固的記憶的再現無影響。

附： 步下法（step-down test），又稱跳臺法 

實驗原理：

依據動物的習性，嚙齒類動物在空曠的場地內，大多時間會逗留于墻邊或角落。而被放在高臺上時，便會依本能迅速跳下，躲避在墻邊或墻角。跳臺儀的底部可以通電，上面放置一個絕緣的跳臺。動物在訓練時受到電擊，跳上跳臺以躲避電擊，從而獲得記憶。動物的記憶力下降時，表現為次從跳臺跳下的潛伏期縮短，跳下的次數增加。動物的記憶力增強時則跳下的潛伏期延長，觸電次數明顯減少。 

實驗程序

1. 適應：將動物放上平臺，使動物在箱內自由上下適應2-3分鐘，然后將動物放回飼養盒。或每次適應10秒，共適應3次，間隔30分鐘。后者使動物較前者更能充分適應實驗者的手勢和整個實驗過程。

2. 訓練：可在適應之后立即進行，也可在適應后24小時進行。

將動物再次放上平臺, 同時開啟電刺激器, 箱底銅柵供電。動物由于在箱內適應過，幾乎馬上跳下平臺，四肢于是立即遭到電擊。由于電擊的疼痛，動物上下跳躍，偶爾于無意之中跳回平臺，旋即又跳下平臺，如此反復多次。

記錄指標：

1）動物從放上平臺至跳下平臺的潛伏期；

2）動物反復下臺的錯誤次數, 可代表動物的學習成績；

3. 重測試：

訓練后24小時重測試, 再次將動物放上平臺，觀察動物下臺情況。

記錄指標：

動物自放上平臺后至跳下平臺的潛伏期、5 分鐘內跳下平臺的錯誤次數, 此為動物的記憶成績。